自第一次发表使用重组病毒从另一种传染原递送抗原进行疫苗接种，至今已有25年了。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）重组的牛痘病毒（VACV）被证明可以表达HBsAg，并且在黑猩猩中诱导出足以防止乙型肝炎感染的免疫。尽管早期有前途和进一步发展，但是许可人类使用的病毒载体疫苗列表很短，部分原因是通往人类执照的漫长而艰难的道路。关于这种疫苗的大规模生产和稳定性的问题通常需要大量的科学投资，并且要求其天然状态下是潜在人类病原体的病毒，必须满足严格的安全要求。对于那些仍然具有复制能力的病毒载体，就其性质而言，这些病毒载体在炎症期以外持续存在于宿主中尤其如此。实际上，在最简单的意义上，仍然有一系列的安全性随着减毒而增加，这必须认为减少的复制能力将导致免疫原性降低的看法相互权衡。然而，尽管存在这些挑战，但可以说驱动病毒载体疫苗持续发展的最重要因素是其有潜力的免疫原性，特别是某些属于世界上最严重的病原体和癌症的抗原（表）。
在大多数情况下，复制性病毒感染在宿主中能有效地持续数年引发强大的免疫应答。这与作为亚单位DNA质粒或蛋白质递送的许多重组抗原相反；虽然这些被认为是相当安全的（取决于佐剂），但它们经常引发较差的反应原性。相反，在体内复制的、具有与野生型亲本相似活力的病毒疫苗载体通常是具有高度免疫原性的，但也具有重组、反应原性或逆转毒性的风险。寻找最佳培养基已经推动了减毒复制缺陷病毒载体的开发，这是旨在最大化免疫原性和安全性的策略（图）。
反应原性：疫苗制剂在接种后诱导不良反应的能力。
减毒病毒作为疫苗载体在过去十年中，病毒疫苗领域的突破之一是认识到复制能力和病毒毒力并不总是与免疫学稳定相关。例如，VACV及其更安全、高度减毒（复制缺陷）表亲——改良的安卡拉痘苗病毒（MVA）和纽约减毒痘苗病毒（NYVAC）在动物研究中显示出堪比的、有时甚至更好的免疫原性。目前，广泛的病毒家族正在作为用于人类或兽医用途的疫苗载体得到深入开发，包括一些具有复制能力的病毒家族，还有许多是特异性减毒的病毒家族。表概述了作为载体正在开发的主要病毒家族及其相关疾病。
表用于人类和兽医的病毒载体疫苗
重组病毒载体
目标
兽医
人类
腺病毒
禽流感病毒、结核杆菌和口蹄疫病毒
恶性疟疾虫、结核杆菌、流感病毒、HIV-、丙肝病毒
志贺氏杆菌噬菌体
无
结核杆菌
金丝雀减毒病毒
马流感病毒、西尼罗河病毒（WNV）、狂犬病毒、猫白血病病毒、犬瘟热病毒
HIV-、癌症
禽痘病毒（FPV）
禽流感病毒、FPV、新城疫病毒
癌症
NDV
禽流感病毒、NDV
无
火鸡疱疹病毒
传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒
无
黄病毒YFV-7D
WNV
WNV、登革热病毒、日本脑炎病毒
慢病毒
无
黑色素瘤、HIV-
麻疹病毒
无
恶性疟原虫、人乳头状瘤病毒
改良的安卡拉痘苗病毒
牛结核分枝杆菌
恶性疟原虫、结核杆菌、甲型流感病毒、结肠癌、肾癌、肺癌、前列腺癌
纽约减毒牛痘病毒
无
恶性疟原虫、HIV-
仙台病毒
无
HIV-
牛痘病毒
狂犬病毒
癌症
YFV-7D，减毒黄热病病毒株7D
免疫逃避：对减毒的影响历史上，病毒的减毒是经验性的，通过在转化的细胞系或非典型宿主中连续传代，和通过非自然途径递送。许多病毒是复杂的病原体，大型DNA病毒如痘病毒，腺病毒（AdVs）和疱疹病毒将其大部分基因组整合至逃避免疫应答的宿主基因。许多这样的病毒基因编码影响特异性免疫防御的蛋白质，包括那些作用于早期先天途径的蛋白质，例如涉及干扰素的途径、模式识别受体（Toll样受体，TLRs），趋化因子和细胞因子，以及那些通过改变病毒肽的主要组织相容性复合物加工来作用于后续适应性反应的药物。迄今为止，大多数减毒过程，例如通过细胞系中的连续体外传代，对于丢失或变化的病毒基因的类型是非选择性的。最终，病毒变异株在小型动物中缺乏有害作用，使得它们不再致病，并且宿主很少或没有损害。然而，在非特异性减毒过程中丢失或改变的病毒基因在将病毒更好地用于具有更强效佐剂效应的重组插入的免疫呈递方面可能不是最佳的。鉴于许多病毒基因组现在已经得到很好的表征，未来为改善病毒载体的佐剂性质而进行设计以诱导不同类型反应的努力将基于靶向对宿主免疫系统有差异的特异性病毒基因。例如，敲除已经进化的减少宿主抗病毒免疫应答的病毒基因可以降低免疫逃避特性并改善某些病毒载体的佐剂特异性特征。然而，抗载体反应可能排除随后在个体中重新使用该载体的可能。
经验还是理性减毒减毒痘病毒在天花根除运动中首次被使用，从而被进一步开发为疫苗载体。其中一种，MVA在鸡胚成纤维细胞中传代超过次，损失了约5％的基因组，最终在哺乳动物细胞中复制缺陷。相反，NYVAC来自VACV的哥本哈根分离株，通过体外重组删除8个不同的ORF，导致复制缺陷。几项最新的研究表明，MVA维持强大的免疫刺激能力，甚至可能比NYVAC更强，而最近的HIV-疫苗候选者的灵长类动物研究显示，这两种痘苗来源的载体诱导定性不同类型的免疫应答编码的Gag-Pol-Nef（组特异性抗原-聚合酶-HIV-阴性因子）和包膜（env）抗原——NYVAC诱导CD4+T细胞显性反应，而MVA诱导更强的CD8+T细胞应答和伴随的CD4+T细胞应答。许多病毒蛋白（其中一些作用于TLR信号通路和其他抗原呈递细胞功能）的联合作用可能解释了这些差异。直到对体内结果有更好的预测分析，该过程很大程度上是经验性的，并且取决于最佳体内模型以评估每种载体的免疫刺激性质。然而，在经验减毒的MVA的情况下，基因的合理缺失可以进一步增强免疫原性，两个报告表明编码可溶性白细胞介素-β（IL-β）受体的B5R的缺失可以增加病毒特异性记忆CD8+T细胞反应。类似地，通过减少重组VACV的载体特异性基因表达，可以减少对载体本身的CD8+T细胞应答，从而相对于转基因而增强。未来的努力将继续沿着这些方向，旨在单独和组合地删除更多的基因，试图合理地增强这些病毒载体的免疫原性。
图一系列共刺激——从佐剂到活病毒
已经开发的减毒的复制缺陷病毒载体作为使免疫原性和安全性最大化的策略的一部分。它们处于一系列复杂性和复制潜力的中间，两种极端的疫苗技术已被许可用于人类使用。虽然临床疫苗开发需要长期的工作计划，但是这种定向疫苗的许可证（如果证明是安全有效的）仍然是完全可以实现和现实的目标。AAV，腺相关病毒；AdV，腺病毒；AS0，葛兰素史克公司的佐剂系统0；HPV，人乳头瘤病毒；MF59，诺华公司的水包油乳液佐剂；MVA，改良的安卡拉痘苗病毒；VEE，委内瑞拉马脑炎病毒；VLP，病毒样粒子。
增强免疫原性初免-加强状况在20世纪90年代，DNA质粒疫苗的出现使人们兴奋。然而很快显而易见的是，DNA疫苗本身的免疫原性不足以产生防止人类困难疾病的T细胞应答。随着临床试验中使用的定量T细胞测定的进展，包括离体干扰素γELISPOT（酶联免疫吸附点）和培养的干扰素-γELISPOT测定以及多参数流式细胞术，与其他疫苗类型相比，病毒载体恢复了其增强的细胞免疫应答效力的中心阶段。然而，与DNA疫苗不同，在体内一次或两次施用后，宿主对病毒载体本身的结构蛋白的反应本身就成为自限型的，当载体用于多次免疫时，导致对疫苗插入物的反应降低。需要开发初免-加强方案以克服这些抗载体反应，同时使宿主对疫苗插入物的反应最大化。
最初，具有常见疫苗插入物的异源初免-加强方案通常使用DNA质粒来引发免疫系统。然而，最近兴趣点在于使用不同重组病毒载体的组合以及它们的施用顺序如何影响诱导的免疫应答的性质。现在已经在动物模型和人类中测试了多种方法，包括DNA-MVA、DNA-NYVAC、禽痘病毒（FPV）-MVA、流感-MVA、AdV-MVA、异源AdV-AdV和DNA-仙台病毒疟疾、艾滋病毒I型、结核病（TB）和丙型肝炎至癌症的许多疾病（表2）。在所有这些研究中，一致的观察是某些向量引发或增强反应的差异能力。DNA疫苗，FPV和流感病毒是良好的启动载体，而痘病毒（MVA和NYVAC）始终能够增强以其他方式引发的T细胞应答。现在大量数据表明，一般而言，重组AdV可以很好地引发和增强T细胞和B细胞的反应。最近，已经使用了表达相同疫苗插入片段的三种不相关载体模式的组合。已经通过更深入的分析来帮助这些载体的评估，特别是使用多参数流式细胞术，其允许不同T细胞群体的表型和细胞因子产生和效应子功能的解剖——由这种不同的载体和方式。将这些不同的免疫方案和载体策略引起的T细胞反应的“质量与数量”的保护性结果相关联仍然是该领域的挑战。
离体干扰素γELISPOT：ELISPOT（酶联免疫吸附斑点）法用于测定抗原特异性效应T细胞应答。典型的，脾细胞或外周血单核细胞与抗原孵育8h，在此期间抗原特异性细胞释放细胞因子（特别是干扰素γ）被单克隆抗体捕获，可以使用改进的ELISA法计算出来。
培养的干扰素-γELISPOT：改进的离体干扰素γELISPOT法，包括一个在干扰素γELISPOT法之前持续很久的体内培养淋巴细胞的过程。典型的，在抗原及白介素-2存在的环境中培养0天。有证据表明不同类群的T细胞，主要是中枢记忆T细胞在培养过程中分化为效应T细胞，可以被此法检测到，类比离体干扰素γELISPOT法定量测定循环效应T细胞。
异源初免-加强：用不同疫苗重复免疫，用于单一疫苗无法诱导足够的保护性应答的情况，以增加更强的免疫应答。
增强体液免疫力。最近的工作已经建立了初免-加强免疫方案用于诱导B细胞以及T细胞应答，特别是AdV-MVA或异源AdV-AdV方案。与分枝杆菌相比，诱导适应性免疫反应的双臂可能有益于防止诸如疟疾寄生虫和许多病毒等病原体，细胞免疫可能是主要的保护机制。与MVA载体相反，AdV载体似乎能够引发和增强B细胞反应，与其引发，MVA载体能够更好地提高反应。这可能是AdV免疫后延长的高水平抗原表达的结果，与更适合于B细胞增强的MVA的短抗原相比，B细胞引发更有利。或者，关于浆细胞样树突状细胞的研究已经表明，一波细胞因子，特别是I型干扰素（IFN），然后是IL-6，对于将B细胞分化为响应于流感病毒感染的效应性浆细胞是必不可少的。相反，通过AdV载体启动转基因特异性抗体反应似乎与I型IFN产生负相关，这也与转基因表达的降低有关。在MVA的情况下，E3L赋予对I型IFN的抗性，并且对于鸡胚成纤维细胞的持续生长是必需的，并且E3L敲除病毒在细胞培养物中诱导增强的I型IFN和II-6鸡的水平。如果通过MVA的B细胞引发以与流感病毒诱导的类似的方式发生，则E3L介导的免疫逃避机制可以解释用该载体观察到的弱B细胞引发。最终，更好地了解细胞因子如何影响不同病毒家族对B细胞反应的诱导，这对于改善载体的合理设计和引发最佳抗体应答的初免-加强策略至关重要。
表2供人类使用的病毒载体疫苗与初免-加强免疫机制的临床开发
重组病毒-载体免疫策略
目标病原体或疾病
目标抗原
疫苗细节
开发者
临床阶段
HAdV-5–HAdV-5
恶性疟原虫疟疾
CSPAMA
单顺反子载体
HAdV-5(delE,E3,E4)注射混合物
NMRC和GenVec
I/IIa
AdCh63–MVA
恶性疟原虫疟疾
ME-TRAP，MSPAMA
单顺序载体
牛津大学和Okairòs大学
I/IIa
HAdV-35
恶性疟原虫疟疾
CSP
没有
Crucell
I
MVA
结核杆菌
85A
BCG-MVA（含有编码85A的基因）
牛津大学和EmergentBioSolutions
IIb功效试验（南非）
HAdV-35
结核杆菌
85A，85B和0.4
融合抗原;（r）BCG素，HAdV-35升高，AERAS-
Aeras和Crucell
I
MVA
甲型流感病毒
NP和M
融合抗原
牛津大学
I
HAdV-5
流感病毒
NP
鼻内管理
GenVec
I
黄病毒YFV-7D（活体嵌合病毒）
WNV
preM-Env
菌株NY99
赛诺菲巴斯德
II
黄病毒YFV-7D（活体嵌合病毒）
登革热病毒
（亚型-4）
preM-Env
菌株PUO-，PUO-28，PaH88和
赛诺菲巴斯德
II
黄病毒YFV-7D（活体嵌合病毒）
日本脑炎病毒
preM-Env
菌株SA-4-4-2
赛诺菲巴斯德
III预注册
DNA-NYVAC
HIV-
Gag-Pol-Nef和Env
CladeC
EuroVacc
I
DNA–MVA
HIV-
Gag,PolandEnv
CladeB
GeoVax
IIa
DNA–HAdV-5
HIV-
Gag-Pol-Nef和Env
HAdV-5（delE，E3，E4）
VRC，NIAID（NIH）和GenVec
II
含有编码HIV-gp60的基因的ALVAC和蛋白gp20
HIV-
gp60和gp20
ALVAC–HIVvCP52初免和AIDSVAX–gp20亚型B/E加强
赛诺菲巴斯德和全球感染性疾病解决方案
III
HAdV-5andHAdV-6
HIV-
Gag–Pol–Nef
MRKAd5和MRKAd6三烯疫苗
默克
I
VACV和ALVAC或FPV有或无联合治疗
癌症
CEA（泛癌）
TRICOM载体共表达B7.，ICAM和LFA3
NIH
I/II
MVA
结肠癌、肾癌、前列腺癌
5T4（实体瘤）
TroVax
牛津生物医学
I-III
MVA
肺癌
MUC
TGvectorco-expressesIL-2
转基因SA
IIb
慢病毒
黑色素瘤
MART
TCR免疫治疗
加州大学和加州大学洛杉矶分校
I
HAdV-6和AdCh3
丙肝病毒
NS3，NS4和NS5
融合抗原NS5的NSmut变异
Okairòs和
牛津大学
I
85a，分枝杆菌Mycolyl转移酶85A抗原；AdCh63，黑猩猩腺病毒血清型63；ALVAC，减毒的金丝雀痘病毒；AMA，顶膜抗原；BCG，牛分枝杆菌卡介苗；CEA，癌胚抗原；CSP，环子孢子蛋白；del，删除；Env，包膜蛋白；FPV，禽痘病毒；Gag，组特异性抗原；gp60，糖蛋白60；HAdV-5，人腺病毒血清型5；ICAM，细胞间粘附分子；IL-2，白介素-2；LFA3淋巴细胞功能相关抗原3；M，基质抗原；MART，被T细胞识别的黑素瘤抗原；ME-TRAP，与多表位串融合的血小板反应素相关粘附蛋白；MSP，裂殖子表面蛋白；MUC，粘蛋白；MVA，修饰的痘苗病毒安卡拉株；Nef，HIV-阴性因子；NIAID（NIH），国家过敏和传染病研究所（美国国立卫生研究院）；NMRC，美国海军医学研究中心NP，核蛋白抗原；NS，非结构蛋白;纽约NYVAC，纽约减毒痘苗病毒；preM，膜前蛋白；（r）BCG，重组BCG；TCR，T细胞受体；TRICOM，共刺激分子三聚体；UCLA，加利福尼亚大学，洛杉矶（美国）；VACV，痘苗病毒；VRC，Dale和BettyBumpers疫苗研究中心；WNV，西尼罗病毒；YFV-7D，减毒黄热病毒株7D
循环预先存在的免疫力。通常感染人类的病毒存在预先存在的免疫力的问题。对于某些病毒载体，例如基于人AdV和疱疹病毒的病毒载体，这可能是一个主要障碍。例如，最近在II型试验中评估了基于人AdV血清型5（HAdV-5）载体的候选HIV-疫苗，在HIV-感染高风险的个体中进行，试验由于缺乏疗效而停止，但是在入组时，在先前存在的较高滴度的HAdV-5-中和抗体的个体中观察到获得增加HIV-感染几率的非显着趋势。这个问题引发了关于使用这种普遍存在的人类病毒作为疫苗载体的激烈辩论，但是尽管HAdV-5载体平台存在这种挫折，研究者仍在积极地采取其他策略来提供可以克服预先存在的载体免疫的可行替代方案。这些方案包括修饰载体以表达异源腺病毒六邻体或使用罕见血清型的人腺病毒或来自其他物种如黑猩猩的腺病毒。重要的是，所有这些新的载体，特别是那些外来物种的新载体，都需要突破监管、安全和制造的障碍。
载体化疫苗的经验与理性设计。随着我们对免疫学和病毒生物学知识的不断扩大，已经建立了新的疫苗科学时代，为病毒载体疫苗的合理开发提供了基础。优化亚单位疫苗抗原设计和理解载体趋势，包括目标抗原加工和体内呈递，是至关重要。在VACV的案例下，已经显示给药途径7以及用于驱动转基因表达的痘病毒启动子可以影响抗原直接或交叉呈递给T细胞的程度。类似地，新的数据表明，由于抗原呈递细胞中的顿挫感染而在感染后期通常被阻止进入直接呈递途径的正痘病毒结构抗原也被特异性地隐藏在病毒工厂中，从而逃避交叉表达途径并阻碍痘病毒特异性CD8+T细胞反应的诱导。痘病毒早期或晚期启动子驱动的外来抗原不是这种情况，因为这些抗原通常不针对这种痘病毒工厂。更好地理解这一系列观察对疫苗诱导的针对载体和转基因的T细胞应答很重要，且这些数据可能解释为什么痘病毒载体如MVA使用相同载体进行免疫接种2个月后重新增强免疫在人体内是有效的。
“工程”免疫。与持续性DNA病毒如腺病毒相关的抗载体免疫的强大复杂性相反，缺乏其大部分结构抗原的工程化慢病毒已被开发用于在体内将基因递送到特定细胞以进行细胞内免疫的载体。某种程度上是由于慢病毒载体基因的最低表达实现的，部分原因是重复的体内给药（如在传统免疫中）不是目的。事实上，慢病毒目前正在被用来为癌症和HIV-设计免疫力。含有T细胞受体基因的慢病毒的造血干细胞的转导现已进入癌症免疫治疗的临床检测。使用这些载体用针对HIV-的中和单克隆抗体的编码的B细胞受体基因转导人CD34+细胞也已经有了大量临床前进展。还开发了将慢病毒载体靶向特定细胞类型（如皮肤树突状细胞（DC））亚类的策略。例如，已经开发了保留结合DC-SIGN（树突状细胞特异性ICAM3-抓住非整联蛋白）蛋白质功能的辛德比斯病毒融合蛋白的突变株。进一步的特异性靶向技术的发展可以大大增强病毒载体疫苗的合理设计、定点诱导和有效的免疫应答以预防广泛的传染病和癌症。
兽医疫苗进展病毒载体疫苗最成功的应用无疑在兽医领域。与开发用于人类的疫苗相反，这需要更严格的监管要求，在人类志愿者中逐步进行临床试验，并获得更长的许可证和投资回报。目前，至少有2种病毒载体疫苗被许可用于兽医用途（表3），还有更多的病毒载体疫苗正在开发中。尽管如此，这些技术仍然面临着经典灭活疫苗竞争的艰难斗争，这些疫苗往往更容易生产。控制家禽禽流感的挑战是由经济学驱动，需要大量疫苗接种策略，如饮用水管理、气溶胶喷雾或卵内免疫接种（图2）。在维持疫苗效力的同时保持给药成本低，为重组病毒载体技术带来了相当大的挑战。一种成功的方法是使用新重组新城疫病毒（NDV），其通过卵内免疫方法一次性提供了控制两种不同禽类病原体的二价方法。正在使用复制缺陷型HAdV-5研究另一种重要和高度传染性的兽医病原体口蹄疫病毒（FMDV）的新疫苗策略。用表达FMDV衣壳和蛋白酶抗原的重组HAdV-5进行单次免疫后7天，在牛和猪中引发了保护性免疫。与灭活的全病毒疫苗不同，使用该载体疫苗平台区分感染和接种动物（DIVA；参见注释框）的能力加上大大增加的生物安全性，使这种有效的技术对于无FMDV的国家非常有利。类似地，对于家畜的重要呼吸道病原体，诸如牛结核病，正在探索重组HAdV-5或MVA疫苗载体。表达了分枝杆菌肌醇转移酶85A抗原的这些载体都被描述为牛分枝杆菌卡介苗（BCG）疫苗的有效增效剂。现在需要进行挑战性实验，以便在直接暴露之后以及在自然传播环境中评估这些BCG初免载体增强方案在免疫牛群中的保护作用。如果单独使用BCG疫苗更有效，使用载体疫苗来加强BCG引发的反应可能有助于控制牛结核病，牛结核病每年预计耗费世界各国的成本约为30亿美元。重要的是，牛结核病继续为候选人类结核病疫苗的设计和测试提供有用的免疫学观点。
表3授权商用的病毒载体兽医疫苗
重组病毒疫苗
目标病原体
目的种群
目标抗原
品牌名称
经销商
ALVAC（加破伤风毒素和羧乙烯聚合物佐剂）
马流感病毒
马
HA（肯塔基和纽马克特柱）
ProteqFlu-Te(欧洲)